Revue Malgache de Biologie Clinique 2025; (1)1 : 023-027

ARTICLE ORIGINAL

Gènes de résistance aux aminoglycosides d’Acinetobacter baumannii résistant  à l’imipénème isolés au laboratoire du Centre Hospitalier Universitaire Joseph Raseta Befelatanana Antananarivo.

Aminoglycoside-resistance genes of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii isolated in the laboratory of the Joseph Raseta Befelatanana University Hospital Antananarivo.

A. C. Razafindrakoto ¹, D. Andriatahiana  ², S. Rasoanandrasana ¹, J. Antilahy, F .A.  Rakotomalala ²,  P. Andrianjakasolo ¹, D. Randriarimanana², A. Rasamindrakotroka ³,

 L.  A. Rakotovao ¹

1. Laboratoire de bactériologie du CHUJRB Antananarivo
2. Laboratoire du CICM Antananarivo
3. Faculté de Médecine d’Antananarivo

Auteur correspondant :

Razafindrakoto Ainamalala Cathérine

E-mail : titarazafy@gmail.com

Téléphone : +261 38 85 866 11

Rmbc 2024004 (2.23 Mo)

Résumé

L’infection à Acinetobacter baumanii constitue un problème majeur de santé publique et , notamment depuis l’apparition des souches multirésistantes spécialement aux aminoglycosides en association avec les bétalactamines pour le traitement de ces infections. Les services de soins intensifs sont les plus concernés par ce problème et peu d’étude ont été faite à cet égard à Madagascar.  L’objectif de notre étude étant identifié les gènes de résistance de ces souches nécessaire pour lutter contre leurs propagations à Madagascar.

Une étude rétrospective et descriptive sur une période de 4 ans a été menée aux laboratoires du Centre Hospitalier Universitaire Joseph Raseta Befelatanana (CHU-JRB), au Centre d’Infectiologie Charles Mérieux (CICM) et le laboratoire du Centre Hospitalier Universitaire (CHU) Avicenne   .

Parmi les 32 isolats d’ Acinetobacter baumannii résistant à l'imipenème (ABRI),   96,90% provenaient du service de réanimation du CHU-JRB et les prélèvements pulmonaires (65,6%) étaient prédominantes. Les gènes codant pour les aminoglycosides phosphotransférases, acétyltransférases, nucléotidyltransférases et adenyltransférases (aadA1) ont été identifiés mais avec une la prépondérance du gène de résistance [aph(6)] 

La mise à disposition de plateau technique permettant la surveillance et la circulation de ces gènes de résistance s’avère nécessaire à Madagascar.

Mots clés : ABRI, aminoglycosides, CHU-JRB, gènes de résistance

Abstract

Acinetobacter baumanii infection is a major public health problem, particularly since the emergence of multidrug-resistant strains, especially to aminoglycosides in combination with betalactam antibiotics used to treat Gram-negative infections such as Acinetobacter baumanii. Intensive care units are most affected by this problem.  The study of resistance genes in these strains is a crucial step in the fight against their spread, but few studies have been carried out in Madagascar.

A retrospective and descriptive study was carried out in the laboratories of the Joseph Raseta Befelatanana University Hospital (JRB-UH), the Charles Mérieux Centre for Infectious Diseases and the laboratory of the Avicenne University Hospital.

Of the 32 isolates of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii (ABRI), 96.90% originated from the intensive care unit of the JRB-HU, with lung specimens (65.6%) predominating. Genes coding for aminoglycoside phosphotransferases, acetyltransferases, nucleotidyltransferases and adenyltransferases (aadA1) were identified, but with a preponderance of the resistance gene [aph(6)]. 

In Madagascar, it is essential to provide a technical platform for monitoring and circulating these resistance genes.

The availability of a technical platform for the monitoring and dissemination of these resistance genes is essential.

 Key words: ABRI, resistance genes, aminoglycosides, CHU-JRB

Introduction

Acinetobacter baumannii est une bactérie opportuniste, rencontrée surtout chez les patients fragiles. C’est une des bactéries les plus redoutées des infections liées aux soins et fait partie du pathogène prioritaire dans la surveillance mondiale de la résistance aux antibiotiques de l’OMS (Global Antimicrobial Resistance Surveillance ou GLASS) [1]. Depuis peu, on assiste à une apparition des souches d’Acinetobacter baumannii résistantes aux antibiotiques utilisés en routine comme les bétalactamines, les aminoglycosides et les quinolones limitant la prise en charge thérapeutique des infectés [2]. Les aminoglycosides sont une famille d’antibiotiques utilisée en association avec les bétalactamines  pour le traitement des infections à bacille gram négatif comme Acinetobacter baumannii. Cependant on assiste de plus en plus à des résistances à ces antibiotiques et elles sont le plus souvent causées par les gènes AME (Aminoglycosides modifying enzymes) à savoir acétyltransférases, phosphotransférases et nucléotidyltransférases [3].

A Madagascar, peu sont les études réalisées sur les gènes de résistance. Les objectifsde notre étude étaient d’identifier les gènes de résistance aux aminoglycosides des souches d’Acinetobacter baumannii résistant à l’imipénème (ABRI) isolées au laboratoire du CHU-JRB et d’évaluer leur fréquence.

Méthodes

Une étude rétrospective et descriptive a été réalisée au laboratoire du CHU-JRB pour la réalisation des examens bactériologiques de routine en collaboration avec le laboratoire du CICM pour l’identification moléculaire par polymérisation Chain reaction (PCR) en temps réel en utilisant des amorces commercialisées et le laboratoire du CHU Avicenne pour le séquençage à haut débit. L’étude a duré 4 ans et 7 mois allant du janvier 2019 en août 2023. Ont été inclus tous les prélèvements cliniques positifs des patients hospitalisés, sans distinction d’âge ni de genre et les prélèvements de surface positifs à ABRI isolés au laboratoire du CHU-JRB entre 2016 et 2019.

Les prélèvements positifs aux autres germes outres qu’A. baumannii et les prélèvements positifs à A. baumannii mais sensible à l’imipenème ont été exclus dans cette étude. Les échantillons dont l’agent pathogène isolé est A. baumanii résistant à l’imipenème ont été inclus dans l’étude.

Les prélèvements ont été ensemencés selon la référentiel en microbiologie médicale (REMIC) 4^ème édition et l'identification biochimique au niveau des espèces a été réalisée à l'aide de la galerie API 20NE (Biomérieux SA, Marcyl'Etoile,France). L’antibiogramme a été réalisée par la méthode de diffusion en suivant la recommandation du Comité d’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CASFM) 2017 dont les molécules testées étaient : Ticarcilline, Ticarcilline - acide clavulanique, Pipéracilline, Pipéracilline–tazobactam, Céfotaxime, Ceftazidime, Céfépime, Imipénème, Gentamicine, Amikacine, Acide nalidixique, Ciprofloxacine, tetracycline, Triméthoprime-sulfaméthoxazole. Tous les isolats d’A. baumanii résistant à l’imipenème (ABRI) ont été triés, mis dans un milieu de conservation (BHI glycérolé) et ensuite gardés dans un réfrigérateur à -20°C. 

L’extraction de l’ADN a été faite par la méthode chimique à l’aide du kit commercialisé SIGMA GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep. Les extraits ont été ensuite amplifiés par PCR en utilisant des amorces commercialisées (tableau I) puis observés après électrophorèse sur  gel d'agarose à 1.5% avec LADDER 100pb. Le séquençage des isolats a été fait dans le laboratoire du CHU d’Avicenne par un séquençage haut débit ou Next Generation sequencing (NGS) de tous les isolats obtenus en adoptant le modèle illumina.  Les séquences obtenues ont été par la suite téléchargées en ligne sur une plate-forme « open access » appelée « Galaxy » (https://www.usegalaxy.org/) pour l’identification des gènes de résistance.

Les données ont été collectées sur le logiciel Microsoft Excel puis importées et analysées à l’aide du logiciel IBM SPSS version 23.0. Le test de Chi-carrée de Pearson avec la p-value correspondante ainsi que le test de Fisher exact ont été utilisés pour la comparaison de plusieurs proportions compte tenu de la faible taille de notre échantillon. La signification statistique a été fixée à p inférieures ou égale à 0.05.

Résultats

Trente-deux isolats d’ABRI ont été colligés au niveau du laboratoire du CHU-JRB pendant la période d’étude dont 20 isolats (65,6%) ont été isolés des prélèvements pulmonaires à type aspiration bronchique et crachat. Tous ces isolats ont été positifs après amplification du gène bla_oxa-51like qui est un gène présent naturellement chez A. baumanii. La majorité des prélèvements positifs à ABRI provenaient dans 96,90% du service de réanimation.

Répartition des isolats selon les gènes de résistance aux aminosides

Plusieurs types de gène de résistance aux aminosides ont été mis en évidence dans les isolats dont la répartition est résumée dans le tableau I.

Les gènes codant pour les aminoglycosides phosphotransférases comprenant aph(3")-Ib, aph (6)-Id, aph(3)-Ia, aph(3’)-Via ; quatre gènes codant pour des aminoglycosides acétyltransférases : aac(3)-IIa, aac(3)-Ia, aac(6’)-Ian, aac(3)-IId, deux gènes codant pour des aminoglycosides nucléotidyltransférases : ant(2")-Ia, ant(3")-Ia et un seul type de  gène codant pour les aminoglycosides adenyltransférases (aadA1).

Tableau I : Répartition des isolats selon les types de gènes codant pour la résistance aux aminosides

Discussion

Durant l’étude, 32 isolats d’ABRI ont été colligés dont 28 dans les prélèvements cliniques et 4 dans les prélèvements de surface. L’identification de nos isolats a été effectuée par API 20NE. Toutefois l’API 20NE est considérée comme une méthode phénotypique traditionnelle, lente, peu fiable et moins efficace pour différencier les A. baumannii du complexe Acinetobacter calcoaceticus-Actcinetobaer baumannii (ACB) [4]. Afin de confirmer nos souches, nous avons eu recours à l’amplification en temps réel du gène «bla_oxa-51 like». En effet, l’identification moléculaire reste le meilleur moyen pour pallier à la mauvaise identification phénotypique des espèces. Les méthodes ciblant un gène spécifique tels que le gène bla _OXA-51, le recA et le gyrB, l’espaceur intergénique ADNr16S-23S et les méthodes basées sur l’analyse de fragment d’ADN après électrophorèse comme PCR-ARDRA et l’AFLP de l’espaceur intergénique, 16S-23S et du gène recA ont été considérés comme des marqueurs appropriés pour la spéciation d'Acinetobacter [4]. Le gène bla_oxa-51 dont les variants sont groupés sous le terme est une oxacillinase naturellement présent sur le chromosome d’A. baumanii et absent pour les autres espèces d’Acinetobacter [5,6]. Au Brésil, Fonseca EL et al. avaient réalisé une étude sur 28 isolats d’ABRI et avaient aussi trouvé que 100% de leurs isolats présentaient le gène bla_oxa-51 [7] tout comme notre étude.

Durant notre étude, les prélèvements d’origine pulmonaires (crachats et aspiration bronchique) ont été les plus représentés avec 65,6% des isolats (tableau I). Un résultat similaire a été retrouvé par Salehi et al. qui ont fait une étude sur les gènes de résistance des souches A.baumanii multirésistant en Iran avec 69,4% d’isolats d’origine pulmonaires [8].  Par contre il  diffère de l’étude  menée par l’équipe de l’institut pasteur de Madagascar dirigé par Tchuinte P. au cours duquel la majorité des isolats  provenaient des prélèvements des plaies [9]. Cette différence pourrait s’expliquer par la taille de notre échantillon qui était plus grande et le service de provenance des prélèvements. A. baumanii est une bactérie opportuniste, elle infecte surtout les patients hospitalisés dans les services de réanimation et de soins intensifs [10-11]. Une réelle constatation durant notre étude avec 96,90% des isolats qui provenaient du service de réanimation et des soins intensifs.

L’expression des AMEs est connue comme le principal mécanisme de résistance aux aminoglycosides et les gènes codants pour les enzymes phosphotransférases, acétyltransférases, nucléotidyltransférase sont présents sur des éléments génétiques transposables [12]. Ces gènes se propagent à d’autres espèces bactériennes à l’aide d’intégrons, plasmides et transformation naturelle. Les isolats porteurs de ces gènes enzymatiques en combinaison ou en tant que gène individuel entrainent une résistance aux aminoglycosides [13-15]. Onze gènes AME ont été identifiés parmi la totalité de nos isolats. Une large gamme de gènes de résistance aux aminoglycosides a été rapportée chez A. baumannii [16]. Plusieurs facteurs tels que les régions géographiques, l'utilisation abusive des antibiotiques et la prescription inappropriée des aminosides peuvent jouer un rôle significatif dans la prévalence des gènes de résistance aux aminoglycosides [17].

Les plus fréquents dans notre étude étaient le gène aph (6)-Id avec 75% suivi par aac(3)-Ia (53,1%), aadA1 (40,6%),  aph(3’)-VIa (37,5%) et aac(3)-IId (37,5%) (Tableau II). Notre étude rejoint ceux d’Asadollahi K et al, effectuée en Iran et de Hujer KM et al effectué aux Etats-Unis où le gène aph(6), était le plus prépondérant  parmi les gènes AME isolés des A. baumanii multirésistants qu’ils ont étudié avec respectivement 90% et 71% [18-19]. Les études provenant de différents pays ont fait état d’une variété de profils de gènes AMEs pour les A. baumannii ; en Chine, une étude de gène de résistance effectuée sur 173 isolats d’A. baumanii provenant d’un centre hospitalier à Beijing avait permis de mettre en évidence 5 gènes AME  dont aac(3)-I (65,69%) ; aac(6’)-Ib, (45,10%); aph(3’)-I (47,06%); aph(3’)-IIb, (0,98%); ant(3″)-I (95,10%) [20]. L’équipe de Yin X. avait effectué une étude sur 31 isolats d’ABRI et a trouvé 6 gènes AME : aac(3)-I, aac(6’)-I, ant(3”)-I, ant(2”)-I, aac (3)-II, et aac(6’)-II dont les proportions sont respectivement 67.7%, 45.2%, 29.0%, 22.6%, 12.9%, et  3.2% [21]. Au Brésil, une étude effectuée sur 100 isolats A. baumanii résistants aux carbapénèmes a permis de mettre en évidence quatre gènes AME : aph(3´)-VI a été prédominant avec 55% d’isolats positifs, suivi par aac(6´)-Ib qui a été détecté dans 47%, aac(3)-Ia dans 27%, et aph(3´)-Ia dans 22% des isolats [7]. Au Pologne, la présence des gènes AME a été recherchée sur 61 isolats d’A. baumanii multirésistants. Parmi les gènes retrouvés, aac(3)-Ia représentait 78.7% des isolats, aph(3’)-VI était présent dans 78.7% et aph(3’)-Ia dans  27.9% [22].  

Dans la présente étude,  la corrélation entre la présence des gènes de résistance et les phénotypes de résistance n’a pas été analysée mais le gène aph(6) a été responsable dans 97% de la résistance à l’amikacine aux Etats-Unis[19]. Bien que des études aient déterminé que l’amikacine était un substrat pour le gène aph(3)-VI et aac(6’)-Ib et la gentamycine  pour les gènes aac3-Ia[22,23]; quelques isolats  porteurs des gènes AME étaient sensibles aux aminoglycosides [22]   et un isolat ne portant aucun des gènes AME  présentait un phénotype résistant[24] aux aminosides suggérant l'apparition d'autres gènes de résistance aux aminosides, l'exposition d'une pompe à efflux ou des mécanismes de résistance supplémentaires comme la méthylation de l’ARN16s.

Remerciements 

Nous remercions tous les personnels du service de laboratoire de bactériologie du CHU-JRB pour l’isolement des souches bactériennes d’ABRI. Nos remerciements vont également
à toute l’équipe du Centre d’Infectiologie Charles Mérieux et du CHU d’Avicenne à travers leur laboratoire de biologie moléculaire et de séquençage.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts.

Références

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